از آنجا که باکتری های دیگری غیر از کلی فرم ها نیز قادر به تولید لاکتوز و تولید گاز می باشند ، بنابراین برای تشخیص قطعی کلی فرم ها لازم است سه دسته از آزمایشها ی زیر انجام شود :

1- آزمایش احتمالی

در این آزمایش از محیط کشت آبگوشت لاکتوز دار یا آبگوشت لوریل تریبتوز استفاده میشود .همانطور که از نام آزمایش حدس زده میشود ، این تست در صورت مثبت بودن فقط برای تشخیص احتمالی کلی فرمها انجام می گیرد ، زیرا ممکن است تعداد دیگری از باکتری ها غیر از کلی فرم ها نیز موجب تخمیر لاکتوز و تولید گاز در محیط کشت شوند .

روش آزمایش
 
برای آنجام آزمایش احتمالی به این ترتیب عمل می شود که سه لوله آزمایش انتخاب نموده و در هر کدام ده میلی لیتر از محیط کشت نامبرده می ریزیم ( محیط کشها باید توسط اتوکلاو استریل شده باشند ) سپس توسط پیپت استریل ده میلی لیتر از نمونه مورد آزمایش به هر کدام از لوله هل اضفه می کنیم .به همین ترتیب دوباره سه لوله دیگر انتخاب نموده و در آنها ده میلی لیتر محیط کشت افزوده و این بار به هر کدام از لوله ها  یک میلی لیتر نمونه اضفه می کنیم . همین کار را برای سه لوله دیگر تکرار نموده بااین تفاوت که در این سه لوله سو مبه هر کدام از لوله ها فقط 1/0 میلی لیتر از نمونه مورد آزمایش را می افزاییم . بنابر این در پایان  9 لوله خواهیم داشت که در هر کدام از آنها نیز یک لوله درهام برای مشاهده گاز تولید شده قرار می دهیم. آنگاه هر 9 لوله را به مدت 24+2 ساعت در انکباتور 35 c الی 37 c قرار میدهیم. بعد از گذشت مدت مذکور لوله ها را از نظر تولید گاز مورد لوله ها را مورد آزمایش قرار میدهیم . لوله هایی را که در آنها گاز تولید میشود به عنوان مثبت یاداشت میکنیم . برای جلوگیری از اشتباه واینکه آیا گازها در لوله های درهام تولید شده و یا اینکه حبابهای ریز هوا در آن بوجود آمده می توان با تلنگر زدن به دیواره لوله از نتیجه آزمایش اطمینان حاصل کرد . در صورتیکه همه لوله ها و یا بعضی از آنها منفی یعنی بدونه گاز هستند باید دوباره آنها را به مدت 24 ساعت دیگر در انکباتور قرار داده و پس از سپری شدن مدت مذکور لوله های با گاز را به عنوان مثبت یادداشت نمود .

بنابر این در این آزمایش ، پیدایش گاز در زیر لوله های درهام دلیل بر این است که احتمالاً در نمونه کلی فرم وجود دارد و در صورتیکه در هیچ کدام از لوله ها گاز تولید نشود ، دلیل بر منفی بودن آزمایش احتمالی یعنی نبودن کلی فرم ها در نمونه مورد آزمایش می باشد.

برای تخمین کلی فرم ها در 100 میلی لیتر نمونه و یا به عبارت دیگر برای تعیین بیشترین تعداد احتمالی (M.P.N) کلی فرمها در 100 میلی لیتر نمونه از جداول مشخص شده استفاده می شود . در صورتیکه جدول در اختیار نباشد و یا شمارش بدست امده با جدول قابل تطبیق نباشد ، می توان برای بدست آوردن MPN در 100 میلی لیتر از فرمول زیر استفاده کرد :

تعداد لوله های مثبت                  *         100                         = MPN در 100 میلی لیتر

 میلی لیتر نمونه در لوله های منفی * میلی لیتر نمونه در تمام لوله ها √


برای بالا بردن دقت این روش ، از روش پنج لوله ای استفاده می شود . در روش پنج لوله ای همه مراحل آزمایش مشابه روش سه لوله ای است ، با این تفاوت که بجای سه دسته لوله سه تایی از سه دسته لوله پنج تایی استفاده می شود .

2- آزمایش تائیدی

از آنجا که باکتری های دیگری غیر از کلی فرم ها نیز قادر به تخمیر لاکتوز و تولید گاز هستند ، نمیتوان گفت که گاز تولید شده در لوله های درهام در آزمایش احتمالی فقط مربوط به آلودگی کلی فرم هاست ، بنابر این برای بدست آوردن اطمینان بیشتر از نتیجه آزمایش باید آزمایش تائیدی انجام شود .در آزمایش تائیدی هم کل کلی فرمها و هم کلی فرم های مقاوم به حرارت تعیین می گردنند.

روش آزمایش

برای انجام آزمایش تائیدی از محیط کشت آبگوشت سبز درخشان داردای لاکتوز و دو درصد صفرا (BGB) استفاده می شود و برای تعیین کلی فرم های مقاوم به حرارت از محیط کشت EC اسفاده می شود.به تعداد لوله های مثبت که از مرحله احتمالی بدست آمده ، لوله های BGB و محیط EC کشت می دهند .

به هر لوله آزمایش 10cc محیط کشت اضافه می گردد و به هر کدان یک لوله درهام بطور وارونه اضافه می شود .سپس درب ان ها را پنبه گذاری کرده و در اتوکلاو استریل می نمایند . پس از استریل شدن و سرد شدن محیط کشت ها ، در کنار شعله کشت انجام میشود . پس از کشت لوله ها را در اتوی 35 درجه سانتی گراد برای محیط کشت BGB و درجه حرارت 44 درجه سانتی گراد برای محیط کشت EC قرار می دهند .البته برای محیط های EC باید حرارت مربوط باشد یا از بن ماری استفاده می شود ور در این مرحله فقط تولید گاز ملاک مثبت بودن آزمایش است.

3-آزمایش تکمیلی

سومین دسته ار آرمایشهای استاندارد MPN کلی فرم ها که برای تشخیص قطعی این باکتری ها لازم است ، آزمایش تکمیلی می باشد که پس از آزمایش تائیدی انجام میگیرد.

روش آزمایش

برای انجام این آزمایش از تمام لوله های مثبت در آزمایش تائیدی ، نمونهای بر روی یک یا چند بشقاب حاوی محیط کشت ENDO یا EMB ( ائوزین متیلن بلوآگار) کشت میدهند . سپس محیط کشت داده شده را به مدت 24 ساعت در انکباتور 35 درجه سانتی گراد قرار می دهند .پس از این مدت کلنی های بدست آمده را مورد مطالعه قرار میدهند .

کلنی هایی که روی محیط کشت ENDO یا EMB رشد کرده اند ، به سه دسته مشخص ، نامشخص و منفی تقسیم میشوند . کلنی های مشخص دارای مرکز سیاه با جلای فلزی میباشند . کلنی های نامشخص به کلنی هایی گفته میشود که بدونه مرگز سیاه ، موکوژی شکل ، غیر شفاف و صورتی رنگ هستند و کلنی های منفی به سایر کلنی های با مشخصات دیگر گفته می شود .سپس از هر بشقاب کشت داده شده ، یک یا چند کلنی مشخص انتخاب نموده و در یک لوله محتوی آبگوشت لاکتوز دار و یک لوله محیط آگار شیب دار کشت میدهند.سپس به مدت 24 یا 48 ساعت در حرارت 35 درجه سانتی گراد قرار می دهند . پیدایش گاز در لوله آگوشت لاکتوز دار ، به منزله مثبت بودن نتیجه آزمایش از نظر کلی فرمهاست . برای تائیید نهایی ، از کلنی های رشد کرده بر روی لوله حاوی آگار شیبدار ، اسلاید تهییه نموده و به روش گرم رنگ آمیزی می نمایند . دیدن باسیل های گرم منفی بدون اسپور دلیل بر وجود کلی فرمها و مثبت بودن نتیجه آزمایش است .